Tải về định dạng Word (104.5KB) Tải về định dạng PDF (2.6MB)

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10809:2015 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng methyl benzoquate - Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10809:2015

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG METHYL BENZOQUATE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuffs - Determination of methyl benzoquate content - High performance liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 10809:2015 được xây dựng dựa theo Commission Regulation (EC) No. 152/2009;

TCVN 10809:2015 do Trung tâm Khảo, kiểm nghiệm và kiểm định giống vật nuôi, thức ăn chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát trin nông thôn đ nghị, Tổng cục Tiêu chun Đo lường Cht lưng thm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG METHYL BENZOQUATE - PHƯƠNG PHÁP SC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuffs - Determination of methyl benzoquate content - High performance liquid chromatographic method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy đnh phương pháp xác định hàm lượng methyl benzoquate (7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone) trong thức ăn chăn nuôi bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao.

Giới hạn định lượng của phương pháp là 1 mg/kg.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu vin dẫn sau rt cần thiết cho vic áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bn được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nht, bao gm c các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi- Chun bị mẫu th

3. Nguyên tắc

Methyl benzoquate được chiết ra khỏi mẫu bằng dung dịch axit methanesulfonic trong metanol. Dịch chiết được tinh sạch bng diclometan, sắc kí trao đi ion và sau đó tinh sạch lại bằng diclometan. Hàm lượng methyl benzoquate được xác đnh bằng cách sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo vi detector UV.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nưc cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy đnh khác.

4.1. Diclometan.

4.2. Metanol, loại dùng cho HPLC.

4.3. Pha động dùng cho HPLC

Hỗn hợp của metanol (4.2) và nước (loại dùng cho HPLC) với tỉ lệ 75 : 25 (thể tích).

Lọc qua bộ lọc màng c l 0,22 mm (5.5) và đuổi khí dung dịch (ví dụ bằng siêu âm trong 10 min).

4.4. Dung dịch axit methanesulfonic, c = 2 %

Pha loãng 20,0 ml axit methanesulfonic bằng metanol (4.2) đến 1000 ml.

4.5. Dung dch axit clohydric, c = 10 %

Pha loãng 100 ml axit clohydric (r20 = 1,18 g/ml) bằng nước đến 1000 ml.

4.6. Nhựa trao đi cation amberlite CG-120 (Na), c 100 mesh đến 200 mesh

Nhựa được xử lý trước khi sử dng. Trộn 100 g nhựa với 500 ml dung dịch axit clohydric (4.5) và đun sôi trên bếp điện, khuấy liên tục. Để nguội và gạn bỏ axit. Lọc qua giy lọc trong điều kiện chân không. Rửa nhựa hai lần mỗi lần 500 ml nước và sau đó rửa bằng 250 ml metanol (4.2). Rửa tiếp bằng 250 ml metanol và làm khô bằng cách cho không khí đi qua phần nhựa thu được. Bảo quản nhựa khô trong chai đậy kín.

4.7. Cht chuẩn: methyl benzoquate (7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone) tinh khiết

4.7.1. Dung dch chuẩn gốc methyl benzoquate, 500 mg/ml

Cân 50 mg cht chun (4.7), chính xác đến 0,1 mg, hòa tan trong dung dịch axit methanesulfonic (4.4) trong bình định mức 100 ml, thêm dung dịch axit methanesulfonic đến vạch và trộn đều.

4.7.2. Dung dch chuẩn trung gian methyl benzoquate, 50 mg/ml

Chuyển 5,0 ml dung dch chun gốc methyl benzoquate (4.7.1) vào bình đnh mức 50 ml, thêm metanol (4.2) đến vạch và trộn đều.

4.7.3. Dung dch hiệu chuẩn

Chuyển 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml và 5,0 ml dung dịch chun trung gian methyl benzoquate (4.7.2) vào một loạt các bình định mức 25 ml. Thêm pha động (4.3) đến vạch và trộn. Các dung dịch này có nng độ methyl benzoquate tương ứng 2,0 mg/ml, 4,0 mg/ml, 6,0 mg/ml, 8,0 mg/ml và 10,0 mg/ml. Các dung dịch này cần được chun b mới trước khi sử dụng.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết b, dụng c thông thưng của phòng thử nghiệm và các thiết b, dụng c sau:

5.1. Máy lắc phòng th nghiệm.

5.2. Bộ cô quay.

5.3. Cột thy tinh, kích thước 250 mm x 15 mm, có khóa vòi và dung tích cột khoảng 200 ml.

5.4. Thiết b HPLC, có detector UV có th thay đổi bước sóng hoặc detector mảng diot.

5.4.1. Cột sắc kí lỏng, kích thước 300 mm x 4 mm, C18, c hạt nhồi 10 mm hoặc loại tương đương.

5.5. Bộ lọc màng, c lỗ 0,22 mm.

5.6. Bộ lọc màng, c l 0,45 mm.

5.7. Bình đnh mức, dung tích 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml và 1000 ml.

5.8. Phễu chiết, dung tích 500 ml và 1 lít.

5.9. Bình cầu đáy tròn, dung tích 500 ml.

5.10. Bình nón, dung tích 250 ml.

5.11. Cân, có thể cân được 50 mg, chính xác đến 0,1 mg.

5.12. Cân, có th cân được 20 g, chính xác đến 0,01 g.

5.13. Cân, có thcân được 100 g, chính xác đến 0,1 g.

5.14. Pipet, có thể phân phối các thể tích thích hợp.

6. Lấy mẫu

Mẫu phải đại diện và không b hư hng hoặc b biến đổi chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

Tiêu chun này không quy định việc lấy mẫu. Nên ly mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mu.

7. Chuẩn bị mẫu thử

Chun b mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498).

8. Cách tiến hành

8.1. Yêu cu chung

8.1.1. Mu trắng

Cần phân tích mẫu trắng đ chắc chn rằng không có mặt methyl benzoquate hoặc chất gây nhiễu.

8.1.2. Kim tra độ thu hồi

Kiểm tra độ thu hồi bằng cách phân tích mẫu trắng được bổ sung một lượng methyl benzoquate tương tự lượng dự kiến đó có mặt trong mẫu. Để bổ sung mức 15 mg/kg, chuyển 600 ml dung dịch chun gốc (4.7.1) vào 20 g mẫu trng, trộn và đợi 10 min trước khi tiếp tục quá trình chiết (8.2).

Mẫu trắng phải cùng loại với mẫu thử và không phát hiện được sự có mặt của methyl benzoquate.

8.2. Chiết

Cân khoảng 20 g mu đã chun b, chính xác đến 0,01 g và chuyn sang bình nón (5.10). Thêm 100,0 ml dung dch axit methanesulfonic (4.4) và lc bằng máy lắc (5.1) trong 30 min. Lọc dung dịch qua giy lọc và giữ lại phn dch lọc cho bước tách pha lỏng-lỏng (8.3).

8.3. Tách pha lng-lỏng

Chuyển 25,0 ml dịch lọc thu được trong (8.2) vào phễu chiết 500 ml (5.8) có chứa 100 ml dung dịch axit clohydric (4.5). Thêm 100 ml diclometan (4.1) vào phễu chiết và lắc trong 1 min. Đ cho tách lớp và tháo lớp phía dưới (diclometan) vào bình cầu đáy tròn 500 ml (5.9). Lặp lại việc chiết pha nước hai lần mỗi lần 40 ml diclometan và gộp lại với phần chiết đầu tiên vào bình cầu đáy tròn. Cho bay hơi cht chiết diclometan đến khô trên thiết bị cô quay (5.2) dưới áp suất giảm ở 40°C. Hòa tan cặn trong 20 ml đến 25 ml metanol (4.2), đậy bình cầu và giữ lại toàn bộ phần dịch chiết để phân tích sắc kí trao đổi ion (8.4).

8.4. Sc kí trao đi ion

8.4.1. Chun b cột trao đổi cation

Chèn một nút bông thủy tinh vào đầu dưới của cột thủy tinh (5.3). Chuẩn bị hồ nhão ca 5,0 g nhựa trao đổi cation đã được xử lý trước (4.6) với 50 ml dung dịch axit clohydric (4.5), đ vào cột thủy tinh và đ cho lắng xuống. Tháo bt axit thừa, ch để cho axit đủ ngập trên b mặt nhựa và rửa cột với nước cho đến khi nước rửa trung tính vi quỳ. Chuyển 50 ml metanol (4.2) vào cột và tháo metanol rút xuống b mặt nhựa.

8.4.2. Sắc kí cột

Dùng pipet chuyn cn thận dch chiết thu được trong (8.3) vào cột. Rửa sạch bình cầu đáy tròn hai lần mỗi lần dùng 5 ml đến 10 ml metanol (4.2) và chuyn nước rửa vào cột. Cho dịch chiết chảy xuống bề mặt nhựa và rửa cột bằng 50 ml metanol, đảm bảo tốc độ dòng không vượt quá 5 ml/min. Loại bỏ nước rửa.. Rửa giải methyl benzoquate ra khỏi cột bằng 150 ml dung dịch axit methanesulfonic (4.4) và thu ly dịch rửa giải cột vào bình nón 250 ml (5.9).

8.5. Tách pha lỏng-lỏng

Chuyển dịch rửa giải thu được (8.4.2) vào phễu chiết 1 lít (5.8). Rửa sạch bình nón bằng 5 ml đến 10 ml metanol (4.2) và gộp nước rửa vào lượng chứa trong phễu chiết. Thêm 300 ml dung dịch axit clohydric (4.5) và 130 ml diclometan (4.1). Lắc 1 min và để yên cho tách pha. Tháo lớp phía dưới (diclometan) cho chảy vào bình cầu đáy tròn 500 ml. Lặp lại việc chiết pha nước hai lần mỗi lần 70 ml dicloromethan và gộp các dịch chiết này với phần dịch chiết đầu tiên trong bình cầu đáy tròn.

Cho bay hơi dịch chiết diclometan đến khô trên bộ cô quay (4.2) dưới áp suất gim 40°C. Hòa tan cặn trong bình cầu bằng khoảng 5 ml metanol (4.2) và chuyn định lượng dung dịch này sang bình định mc 10 ml. Rửa bình cầu đáy tròn hai lần mỗi lần 1 ml đến 2 ml metanol và chuyn sang bình định mức. Thêm metanol đến vạch và trộn. Phn dịch nước được lọc qua bộ lọc màng (5.6). Dung dịch này dùng để xác định bằng HPLC (8.6).

8.6. Xác đnh bằng HPLC

8.6.1. Thông s

Nên sử dụng các điu kiện sau đây, có thể s dụng các điều kiện khác nếu cho kết qu tương đương:

- Cột sắc kí lỏng (5.4.1);

- Pha động HPLC: hỗn hợp metanol-nước (4.3);

- Tốc độ dòng: từ 1 ml/min đến 1,5 ml/min;

- Thể tích bơm: 20 ml đến 50 ml,

- Bước sóng phát hiện: 265 nm;

Kiểm tra sự ổn định của h thống sắc kí bằng cách bơm vài lần dung dịch hiệu chun (4.7.3) có nồng độ 4 mg/ml, cho đến khi đạt đưc chiều cao (din tích) pic và thời gian lưu n định.

8.6.2. Dựng đường chuẩn

Bơm mỗi dung dịch hiệu chun (4.7.3) vài ln và xác định chiều cao (diện tích) pic đối với mỗi nồng độ. Dựng đường chun bằng cách sử dụng chiều cao (diện tích) pic trung bình của dung dịch hiệu chun trên trục tung và nồng độ tương ứng tính bng mg/ml trên trục hoành.

8.6.3. Dung dch mu

Bơm vài lần dịch chiết mẫu thu được trong 8.5, sử dng cùng một thể tích như đã dùng đối với dung dịch hiệu chun và xác định chiu cao (diện tích) trung bình của pic methyl benzoquate.

Xác định nồng độ methyl benzoquate có trong dung dịch mẫu từ chiu cao (diện tích) pic trung bình có trong dung dịch mẫu, sử dụng đường chuẩn (8.6.2).

9. Tính kết quả

Tính hàm lượng methyl benzoquate trong mẫu, w(mg/kg), theo công thức sau:

w =

Trong đó:

c là nồng độ methyl benzoquate trong dung dịch mẫu, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

40 là thể tích dung dch thu được từ 8.5 tương ứng với phần mẫu th ban đu (m), tính bằng mililit (ml);

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

10. Đánh giá xác nhận kết quả

10.1. Nhn biết

Việc nhận biết chất phân tích có th được khẳng đnh bằng đồng sắc kí hoặc sử dụng detector mảng diot để so sánh phổ đ của dch chiết mẫu (8.2) và của dung dịch hiệu chun (4.7.3) có nng độ 10 mg/ml.

10.1.1. Đng sắc kí

Bổ sung một thể tích thích hợp dung dịch chuẩn trung gian (4.7.2) vào dch chiết mẫu. Lượng methyl benzoquate bổ sung phải xp xỉ hàm lượng methyl benzoquate dự kiến tìm thy trong dịch chiết mẫu.

Chỉ có chiều cao pic methyl benzoquate tăng sau khi tính cả lượng bổ sung và độ pha loãng ca dịch chiết. Sai khác và chiều rộng pic tại điểm giữa chiều cao phải nằm trong phạm vi ± 10 % chiều rộng gốc.

10.1.2. Detector mảng diot

Các kết quả được đánh giá theo các tiêu chí sau:

a) tại bước sóng tương ứng vi độ hấp thụ cực đại, phổ đ ca mẫu và của chất chun, được ghi lại đnh cao nhất trên sc kí đồ, phải giống nhau trong một biên độ được xác định bằng khả năng phân gii của hệ thống detector. Đối với detector mảng diot, biên độ đặc trưng là ± 2 nm;

b) tại bước sóng từ 220 nm đến 350 nm, phổ đ của mẫu và của cht chun được ghi lại đỉnh cao nht trên sắc kí đồ không được khác với các phần phổ đ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của cht phân tích chuẩn;

c) tại bước sóng từ 220 nm đến 350 nm, ph đồ của điểm uốn lên, đỉnh cao nht và điểm uốn xuống của pic cht phân tích không được khác với các phần phổ đ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp th tương ứng với phổ đồ ca đỉnh cao nhất.

Nếu một trong các tiêu chí này không đáp ứng thì không xác nhận được sự có mặt của chất phân tích trong mẫu.

11. Độ lặp lại và độ thu hồi

11.1. Độ lặp lại

Chênh lệch giữa kết quả của hai phép xác đnh song song, thực hiện trên cùng một mẫu không được vượt quá 10 % giá tr cao hơn khi hàm lượng methyl benzoquate trong khoảng từ 4 mg/kg đến 20 mg/kg.

11.2. Độ thu hồi

Đối với các mẫu thức ăn chăn nuôi (mẫu trắng) được thêm chuẩn, độ thu hi ít nht là 90 %.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đy đủ v mẫu thử;

b) phương pháp ly mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chun này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có th ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết qu thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cui cùng thu được.

 

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

KẾT QUẢ CỦA PHÉP THỬ NGHIỆM CỘNG TÁC

Một nghiên cứu cộng tác đã được tổ chức thực hiện trên năm mẫu. Mỗi mẫu đã thực hiện hai phép phân tích lặp lại.

Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác được nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 - Kết quả của phép thử nghim cộng tác

 

Mu trắng

Dạng bột 1

Dạng vn 1

Dạng bột 2

Dạng vn 2

Giá trị trung bình [mg/kg]

Không phát hiện

4,50

4,50

8,90

8,70

Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, [mg/kg]

-

0,30

0,20

0,60

0,50

Hệ số biến thiên lặp lại, CVr, [%]

-

6,70

4,40

6,70

5,70

Độ lệch chun tái lập, sR, [mg/kg]

-

0,40

0,50

0,90

1,00

Hệ s biến thiên tái lập, CVR [%]

-

8,90

11,10

10,10

11,50

Độ thu hồi [%]

-

92,00

93,00

92,00

89,00

 

Tìm kiếm

Thông tin Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN10809:2015
Loại văn bảnTiêu chuẩn Việt Nam
Số hiệuTCVN10809:2015
Cơ quan ban hành
Người ký***
Lĩnh vựcCông nghệ- Thực phẩm
Ngày ban hành...
Ngày hiệu lực...
Tình trạng hiệu lựcKhông xác định
Cập nhật3 năm trước