Tải về định dạng Word (84KB) Tải về định dạng PDF (2.6MB)

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10812:2015 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng amprolium - Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10812:2015

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMPROLIUM - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuffs - Determination of amprolium content - High performance liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 10812:2015 được xây dựng dựa theo Commission Regulation (EC) No. 152/2009;

TCVN 10812:2015 do Trung tâm Khảo, kiểm nghiệm và kim định giống vật nuôi, thức ăn chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đ nghị, Tổng cục Tiêu chun Đo lường Chất lượng thm đnh, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMPROLIUM - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuffs - Determination of amprolium content - High performance liquid chromatographic method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng amprolium (1-[(4-amino-2-propylpyrimidin- 5-yl)methyl]-2-methyl-pyridinium chlorid hydrochlorid) trong thức ăn chăn nuôi bằng sắc ký lng hiệu năng cao.

Tiêu chun này cũng có th áp dụng đi vi premix.

Phương pháp này có giới hạn phát hiện là 1 mg/kg và giới hạn định lượng là 5 mg/kg.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rt cần thiết cho việc áp dụng tiêu chun này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6952 (ISO 9498) Thc ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mu th

3. Nguyên tắc

Amprolium được chiết ra khỏi mẫu bằng hỗn hợp nước-metanol. Sau khi pha loãng bng pha động và lọc qua bộ lọc màng, hàm lượng amprolium được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trao đổi cation với detector UV.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước ct hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, tr khi có quy định khác.

4.1. Metanol.

4.2. Axetonitril, loại dùng cho HPLC.

4.3. Nước, loại dùng cho HPLC.

4.4. Dung dịch natri dihydro phosphat, c = 0,1 mol/l.

Hòa tan 13,80 g natri dihydro phosphat ngậm một phân tử nước trong nước (4.3) đựng trong bình định mức 1000 ml, thêm nước (4.3) đến vạch và trộn.

4.5. Dung dch natri perchlorat, c = 1,6 mol/l.

Hòa tan 224,74 g natri perchlorat ngậm một phân tử nước trong nước (4.3) trong bình định mức 1000 ml, thêm nước (4.3) đến vạch và trộn.

4.6. Pha động dùng cho HPLC

Trộn axetonitril (4.2), dung dịch natri dihydro phosphat (4.4) và dung dịch natri perchlorat (4.5) vi tỷ lệ 450 : 450 :100 (thể tích). Trước khi sử dụng, lọc hỗn hợp này qua bộ lọc màng c lỗ 0,22 μm (5.3) và loi khí dung dịch (ví dụ: cho vào b siêu âm (5.4) ít nhất 15 min).

CHÚ THÍCH: Nếu mu chứa thiamin thì pic thiamin trong phổ đ xut hiện ngay trước pic amprolium, khi đó phải tách thiamin. Nếu không th tách thiamin trên cột (5.1.1) thì thay 50 % phn th tích axetonitril trong dung môi pha động bằng metanol.

4.7. Cht chun: amprolium [1-[(4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl) methyl-2-methyl-pyridinium chlorid hydrochlorid] tinh khiết, ký hiệu: E 750.

4.7.1. Dung dch chuẩn gc amprolium, 500 μg/ml

Cân 50 mg amprolium, chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan trong 80 ml metanol (4.1) và đặt bình vào bể siêu âm (5.4) trong 10 min. Sau khi siêu âm, làm nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng, thêm nước đến vạch và trộn. Khi được bảo quản nhiệt độ không lớn hơn 4 °C, dung dịch bn trong 1 tháng.

4.7.2. Dung dịch chun trung gian amprolium, 50 μg/ml

Dùng pipet ly 5,0 ml dung dch chun gc (4.7.1) cho vào bình đnh mức 50 ml, thêm dung môi chiết (4.8) đến vạch và trộn. Khi được bảo quản nhiệt độ không lớn hơn 4 °C, dung dịch bn trong 1 tháng.

4.7.3. Dung dch hiệu chuẩn

Chuyn 0,5 ml, 1,0 ml và 2,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.7.2) vào một dãy các bình định mức 50 ml. Thêm pha động (4.6) đến vạch và trộn. Các dung dịch này chứa nồng độ amprolium tương ứng 0,5 μg/ml, 1,0 μg/ml và 2,0 μg/ml. Các dung dch này cần được chun bị mi trước khi sử dụng.

CHÚ THÍCH: Phổ đồ của dung dịch amprolium (nồng độ 0,02 mol/l) trong axit clohydric cho thy độ hấp thụ cực đại ở các bước sóng 246 nm và 262 nm. Độ hấp th phải bằng 0,84 246 nm và bằng 0,80 ở 262 nm.

4.8. Dung môi chiết

Hỗn hợp của metanol (4.1) và nưc: tỷ l 2:1 (th tích).

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết b, dụng cụ thông thưng của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1. Thiết b HPLC có h thng bơm, thích hợp để bơm các th tích 100 μl.

5.1.1. Cột sắc kí lỏng, kích thước 125 mm x 4 mm, Nucleosil 10 SA trao đi cation, c hạt nhồi 5 μm hoặc 10 μm hoặc loại tương đương.

5.1.2. Detector UV, có thể thay đổi bước sóng hoặc detector mảng diot.

5.2. Bộ lọc màng, c l 0,45 μm

5.3. Bộ lọc màng, c lỗ 0,22 μm.

5.4. B su âm

5.5. Máy lắc cơ học hoặc bộ khuy từ

5.6. Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml và 1000 ml.

5.7. Bình nón, dung tích 250 ml và 500 ml.

5.8. Cân, có th cân được 50 mg, chính xác đến 0,1 mg.

5.9. Cân, có th cân được 5 g, chính xác đến 0,001 g.

5.10. Cân, có thể cân được 50 g, chính xác đến 0,01 g.

5.11. Cân, có th cân được 500 g, chính xác đến 0,1 g.

5.12. Pipet, có th phân phối các thể tích thích hợp.

6. Lấy mẫu

Mẫu phải đại diện và không b hư hỏng hoặc b biến đổi cht lượng trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

Tiêu chuẩn này không quy định việc ly mẫu. Nên ly mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu.

7. Chuẩn bị mẫu thử

Chun bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498).

8. Cách tiến hành

8.1. Yêu cầu chung

8.1.1. Mu trắng

Để kiểm tra độ thu hồi (8.1.2), cần phân tích mẫu trắng để chắc chn rằng không có mt amprolium hoặc chất gây nhiễu. Mẫu trắng phải cùng loại với mẫu thử nhưng không phát hiện được amprolium hoặc chất gây nhiễu.

8.1.2. Kiểm tra độ thu hồi

Kiểm tra độ thu hồi bằng cách phân tích mẫu trắng được bổ sung một lượng amprolium tương tự lượng dự kiến đó có mặt trong mẫu. Để bổ sung mức 100 mg/kg, chuyển 10,0 ml dung dịch chun gốc (4.7.1) vào bình nón 250 ml (5.7) và cho bay hơi dung dch đến khoảng 0,5 ml. Thêm 50 g mẫu trắng, trộn kỹ và để 10 min, trộn lại vài lần trước khi tiếp tục chiết (8.2).

Nếu không sẵn có mẫu trắng cùng loại với mẫu thử (xem 8.1.1) thì có thể kim tra độ thu hồi bằng phương pháp thêm chun. Trong trưng hợp này, mẫu phân tích được b sung một lượng amprolium tương tự với lượng dự kiến có trong mẫu. Mẫu này được phân tích cùng với mẫu không thêm chuẩn và t kết quả thu được tính độ thu hồi.

8.2. Chiết

8.2.1. Thức ăn chăn nuôi và premix (chứa hàm lượng amprolium < 1="">

Cân từ 5 g đến 40 g mẫu, chính xác đến 0,01 g, tùy thuộc vào hàm lượng amprolium cho vào bình nón 500 ml và thêm 200 ml dung môi chiết (4.8). Đặt bình vào bể siêu âm (5.4) và đ 15 min. Ly bình ra khỏi b siêu âm và lc bình trên máy lắc hoặc khuy bằng máy khuy từ (5.5) trong 1 h. Pha loãng phần nước của dịch chiết bằng pha động (4.6) đến khi thu được hàm lượng amprolium từ 0,5 μg/ml đến 2 μg/ml và trộn. Lọc khoảng 5 ml đến 10 ml dung dịch đã pha loãng bằng bộ lọc màng (5.2). Tiếp tc xác đnh bằng HPLC (8.3).

CHÚ THÍCH: Dịch chiết phải được pha loãng bằng dung môi pha động, nếu không thì thời gian lưu của pic amprolium có th bị thay đi đáng k do sự thay đi nồng độ ion.

8.2.2. Premix (chứa hàm lượng amprolium ³ 1 %)

Cân từ 1 g đến 4 g premix, chính xác đến 0,001 g, tùy thuộc vào hàm lượng amprolium, cho vào bình nón 500 ml và thêm 200 ml dung môi chiết (4.8). Đặt bình vào b siêu âm (5.4) và để 15 min. Ly bình ra khi bể siêu âm và lắc trên máy lắc hoặc khuấy bằng máy khuấy từ (5.5) trong 1 h. Pha loãng phần nước của dịch chiết bằng pha động (4.6) đ thu được hàm lượng amprolium từ 0,5 μg/ml đến 2 μg/ml và trộn. Lọc khoảng 5 ml đến 10 ml dung dịch đã pha loãng trên bộ lọc màng (5.2). Tiếp tục xác định bằng HPLC (8.3).

8.3. Xác đnh bằng HPLC

8.3.1. Thông s

Nên sử dụng các điều kin sau đây, có thể sử dụng các điều kiện khác nếu cho kết quả tương đương:

- Cột sắc kí lỏng (5.1.1): kích thước 125 mm x 4 mm, Nucleosil 10 SA trao đổi cation, c hạt nhồi 5 μm hoặc 10 μm, hoặc loại tương đương;

- Pha động (4.6): Hỗn hợp của axetonitril (4.2), dung dịch natri dihydro phosphat (4.4) và dung dịch natri perchlorat (4.5), tỷ l 450:450:100 (thể tích).

- Tốc độ dòng: 0,7 ml/min đến 1 ml/min;

- Thể tích bơm: 100 μl;

- Bước sóng phát hiện: 264 nm.

Kiểm tra sự ổn định của hệ thống sắc kí bằng cách bơm vài lần dung dịch hiệu chun (4.7.3) có nồng độ 1,0 μg/ml, cho đến khi đạt được chiu cao (diện tích) pic và thời gian lưu ổn định.

8.3.2. Dựng đường chuẩn

Bơm mi dung dịch hiệu chun (4.7.3) vài ln và xác định chiu cao (diện tích) pic trung bình đối với mỗi nng độ. Dựng đường chun bằng cách sử dụng chiu cao (diện tích) pic trung bình trên trục tung và nng độ tương ứng tính bằng μg/ml trên trục hoành.

8.3.3. Dung dch mẫu

m vài lần dịch chiết mu thu được trong 8.2, sử dụng cùng một th tích như đã dùng đối với dung dịch hiệu chun và xác định chiều cao (diện tích) trung bình của pic amprolium.

Xác định nồng độ amprolium có trong dung dịch mẫu từ chiều cao (diện tích) pic trung bình có trong dung dịch mẫu, tính bằng microgam trên mililit, sử dụng đường chuẩn (8.3.2).

9. Tính kết quả

Tính hàm lượng amprolium trong mẫu, w (mg/kg), theo công thức sau:

Trong đó:

V là thể tích dung môi chiết (4.8), tương ứng với 8.2, tính bng mililit (trưng hp này là 200 ml);

c là nồng độ amprolium trong dịch chiết mẫu (8.2) tính bằng microgam trên mililit (μg/ml);

m là khi lượng phần mẫu th (8.2) tính bằng gam (g);

f là hệ s pha loãng theo 8.2.

10. Đánh giá xác nhận kết quả

10.1. Nhận biết

Việc nhận biết cht phân tích có thể được khẳng định bằng đng sắc ký hoặc sử dụng detector mảng diot để so sánh phổ đ của dịch chiết mẫu (8.2) và của dung dịch hiệu chuẩn (4.7.3) có nồng độ 2,0 μg/ml.

10.1.1. Đồng sắc ký

B sung một thể tích thích hợp dung dịch hiệu chun (4.7.3) vào dịch chiết mẫu (8.2). Lượng amprolium bổ sung phải xấp x lượng amprolium dự kiến tìm thấy trong dịch chiết mẫu.

Chỉ có chiu cao pic amprolium tăng sau khi tính cả lượng bổ sung và độ pha loãng của dịch chiết. Sai khác v chiều rộng pic tại điểm giữa chiu cao phải nằm trong phạm vi ± 10 % chiu rộng gốc của pic amprolium trong dịch chiết mu không thêm chuẩn.

10.1.2. Detector mng diot

Các kết quả được đánh giá theo các tiêu chí sau:

a) tại bước sóng tương ng với độ hp thụ cực đại, phổ đ của mẫu và của chất chuẩn, được ghi lại đỉnh cao nht trên sắc ký đồ, phải giống nhau trong một biên độ được xác định bằng khả năng phân giải của hệ thống detector. Đối với detector mảng diot, biên độ đặc trưng là ± 2 nm;

b) tại bước sóng từ 210 nm đến 320 nm, phổ đồ của mẫu và của cht chun được ghi lại đỉnh cao nhất trên sc kí đồ không được khác vi các phn phổ đồ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của cht phân tích chuẩn;

c) tại bưc sóng từ 210 nm đến 320 nm, phổ đ của đim un lên, đnh cao nht và điểm uốn xuống của pic cht phân tích không được khác với các phn phổ đồ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đi. Tiêu chí này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ tương ứng với phổ đồ của đỉnh cao nht.

Nếu một trong các tiêu chí này không đáp ứng thì không xác nhận được sự có mặt của chất phân tích trong mẫu.

11. Độ lặp lại và độ thu hồi

11.1. Độ lặp lại

Chênh lệch giữa kết quả của hai phép xác định song song, thực hiện trên cùng một mẫu không được vượt quá:

- 15 % giá trị cao hơn, khi hàm lượng amprolium từ 25 mg/kg đến 500 mg/kg;

- 75 mg/kg, khi hàm lượng amprolium từ 500 mg/kg đến 1000 mg/kg;

- 7,5 % giá trị cao hơn, khi hàm lượng amprolium lớn hơn 1000 mg/kg.

11.2. Độ thu hồi

Đối với các mẫu thức ăn chăn nuôi (mẫu trắng) được thêm chun, độ thu hồi ít nhất là 90 %.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết đ nhận biết đầy đủ v mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chun này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chun này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bt thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu v độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.

 

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác

Một nghiên cu cộng tác đã được tổ chức thực hiện trên ba mẫu thức ăn gia cầm (mẫu 1 đến mẫu 3), một mẫu khoáng (mẫu 4) và một mẫu premix (mẫu 5).

Kết quả của phép th nghiệm cộng tác được nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 - Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác

 

Mẫu 1 (mẫu trng)

Mẫu 2

Mu 3

Mu 4

Mẫu 5

Số lượng phòng thử nghiệm

14

14

14

14

15

Số lượng kết quả đơn lẻ

56

56

56

56

60

Giá trị trung bình [mg/kg]

-

45,5

188

5129

25140

Độ lệch chun lặp lại, sr [mg/kg]

-

2,26

3,57

178

550

Hệ số biến thiên lặp lại, CVr [%]

-

4,95

1,90

3,46

2,20

Độ lệch chuẩn tái lập, sR [mg/kg]

-

2,95

11,8

266

760

Hệ số biến thiên tái lập, CVR [%]

-

6,47

6,27

5,19

3,00

Hàm lượng danh định [mg/kg]

-

50

200

5000

25000

 

Tìm kiếm

Thông tin Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN10812:2015
Loại văn bảnTiêu chuẩn Việt Nam
Số hiệuTCVN10812:2015
Cơ quan ban hành
Người ký***
Lĩnh vựcCông nghệ- Thực phẩm
Ngày ban hành...
Ngày hiệu lực...
Tình trạng hiệu lựcKhông xác định
Cập nhật4 năm trước