Tải về định dạng Word (160.5KB) Tải về định dạng PDF (1.6MB)

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11135:2015 về Vi sinh vật trong thực phẩm - Phát hiện độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11135:2015

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F

Microbiology of food - Detection of botulinal neurotoxins A, B, E and F

Lời nói đầu

TCVN 11135:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2002.08 Detection of Botulinal Neurotoxins A, B, E, and F. Amplified ELISA System;

TCVN 11135:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

VI SINH VT TRONG THC PHM - PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F

Microbiology of food - Detection of botulinal neurotoxins A, B, E and F

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện các độc t thần kinh typ A, B, E và F do vi khun Clostridium botulinum sinh ra (botulinal neurotoxin) khi nuôi cấy trong môi trường chất chiết nm men glucose pepton trypton (TPGY) và môi trường canh thang thịt (CMM) nguyên chất.

Kết quả nghiên cu liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bn được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nht, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 9049:2012, Thực phm - Xác định Clostridium botulinum và độc tố của chúng bằng phương pháp vi sinh

3.  Nguyên tắc

Phương pháp này được dùng để phát hiện các độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F trong các môi trường nuôi cấy TPGY và CMM nguyên chất, sử dụng kỹ thuật ELISA (Th nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn kết enzym). Các độc tố b bắt giữ bởi các kháng thể immunoglobin G (IgG) được phủ trên các đĩa vi giếng (microtiter plate) và được phát hiện bằng cách sử dụng các IgG đã biotinyl hóa và các chất cộng hợp phosphatase kiềm streptavidin. Enzym gắn kết được quan sát bằng cách sử dụng cơ cht được khuếch đại.

4. Thuốc thử

4.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.2. Dung dịch đệm cacbonat-bicacbonat, 0,05 M, pH 9,6 ± 0,1

Hòa tan lượng chứa trong một viên nang bicacbonat (ví dụ: Cat.No.C-3041; Sigma, St. Louis, MO) trong 100 ml nước.

4.2. Dung dịch đệm casein, 1,0 %

Cho một túi bột muối đệm phosphat (PBS) (ví dụ: Sigma; Cat.No. P3813) vào 800 ml nước, 10 g casein không chứa vitamin (ví dụ: Research Organics, Cleveland, OH 44125-1083, www.resorg.com; Cat. No.1087C) và 3 ml dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 M (tương đương 4,0 g NaOH/100 ml nước).

Làm nóng đến khoảng 80 °C trong khi vẫn khuy. Chỉnh đến pH 7,9 ± 0,1 bằng dung dịch natri hydroxit 1 M; sau đó pha loãng đến 1 lít. Khử trùng ở 121 °C trong 20 min. pH cuối cùng phải là 7,6 ± 0,1.

4.3. Dung dịch natri hydroxit (NaOH), 1 M.

4.4. Kháng độc tố typ A, B, E hoặc F, ví dụ: Southeast Regional Laboratory, Atlanta, GA 30309-3998.

4.5. Kháng độc tố typ A, B, E hoặc F đã biotin hóa, ví dụ: Atlanta, GA 30309-3998.

4.6. Dung dịch đệm rửa Tween (TBS-T) - nước muối đệm Tris, Tris-axit clohydric (HCI) 0,05 M, natri clorua (NaCI) 0,138 M, kali clorua (KCI) 0,0027 M

Cho lượng chứa trong một gói TBS, ví dụ: Sigma; Cat.No. T6664 hoặc loại tương tự vào 900 ml nước, chỉnh pH đến 7,5 ± 0,1 bằng axit clohydric 2 M, cho 0,05 ml Tween-20 (ví dụ: Curtin Matheson Inc., PO Box 1546, Houston, TX 77251-1546) hoặc tương đương và pha loãng đến 1 lít. Nồng độ cuối cùng của Tween là 0,005 %.

4.7. Chất cộng hợp (conjugate) phosphatase kiềm-ExtraVidin, ví dụ: Cat. No. E2636. Bo qun dung dịch ở 4 °C.

4.8. Hệ cơ chất ELISA khuếch đại, gồm cơ chất và chất khuếch đại (ví dụ: Invitrogen Corp., PO Box 6482, Carlsbad, CA 92008, www.invitrogen.com; Cat. No. 19589-019).

4.9. Axit sulfuric (H2SO4), 0,3 M

Pha loãng axit sulfuric đậm đặc (96 % đến 98 %), bằng cách cho 1 ml axit này vào 59 ml nước.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết b, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể các thiết b, dụng cụ sau:

5.1. Khay vi giếng hoặc đĩa 96 giếng.

5.2. Màng chất do để bọc đĩa vi giếng.

5.3. Pipet đa kênh, 8 hoặc 12 v trí, dung tích từ 50 μl đến 200 μl.

5.4. Pipet dùng cho đĩa vi giếng, có thể phân phối được từ 0,2 μl đến 100 μl.

5.5. T m, có thể duy trì nhiệt độ ở 35 °C ± 2 °C.

5.6. Máy rửa đĩa vi giếng, có cài đặt chương trình.

5.7. Máy lắc đĩa vi giếng.

5.8. Máy đọc đĩa vi giếng, có các bộ lọc cỡ lỗ 490 nm và 630 nm.

5.9. Pipet dùng một lần, dung tích 1 ml, 5 ml và 10 ml, được chia vạch tương ứng là 0,01 ml, 0,1 ml và 0,1 ml.

5.10. B chứa pipet đa kênh.

6. Cách tiến hành

6.1. Yêu cầu v an toàn

Độc tố botulinum là chất cực độc đối với con người. Chỉ cần một lượng nhỏ qua đường tiêu hóa, hô hấp, hấp thụ qua mắt, hoặc tiếp xúc trực tiếp qua vết xước ở da cũng có thể gây nhiễm độc sâu và dẫn đến tử vong. Nhân viên phòng thử nghiệm cần được tiêm phòng vacxin phòng ngừa độc tố botulinum. Sau khi sử dụng, rửa sạch máy rửa đĩa vi giếng bằng nước cất, sử dụng nguyên tắc bo dưỡng. Thu lấy chất thải vào bể chứa chất thải và kh trùng ở 121 °C trong 60 min. Không được có độc tố trong đưng ống máy rửa sau khi sử dụng thiết bị.

6.2. Quy trình ELISA khuếch đại

Chun bị 1 đĩa vi giếng (5.1), cho từng loại độc tố cần kiểm tra. Đánh du đĩa typ A, B, E hoặc F. Sử dụng micropipet (5.4) đ hút các kháng độc tố gốc. Pha loãng kháng độc tố (4.4) với dung dịch đệm bicacbonat (4.2), trong các ống nghiệm thủy tinh theo quy định của nhà cung cấp. Chuyển các kháng độc tố pha loãng vào các kênh của bể chứa pipet đa kênh (5.10). Sử dụng pipet đa kênh 8 v trí (5.3) hút 100 μl dung dịch pha loãng thích hợp của các kháng độc tố typ A, B, E hoặc F từ các kênh của bể chứa, phân phối vào từng giếng của mỗi đĩa vi giếng. Cần có bốn đĩa (mỗi đĩa cho một typ: A, B, E và F). Các đĩa được ph bằng màng cht do (5.2) và bảo quản ở 4 °C ± 2 °C qua đêm.

Lấy đĩa ra khỏi tủ bảo quản ở 4 °C ± 2 °C và rửa đĩa 5 lần trong TBS-T (4.6), thời gian giữa các lần rửa cách nhau 45 s ± 5 s. Sử dụng máy rửa đĩa (5.6) hoặc thiết bị cơ học khác. Không sử dụng chai dạng bóp để ra. Cho dung dịch đệm casein (4.2) đầy đến miệng các giếng của mỗi đĩa (khoảng 300 μl) và để trong tủ ấm (5.5) từ 60 min đến 90 min ở 35 °C ± 2 °C. Không ra đĩa khi lấy ra. Các đĩa vẫn ph màng chất dẻo trong thời gian rã đông dịch cấy thử nghiệm ở nhiệt độ phòng. Sau đó, tháo tấm phủ, loại b dung dịch đệm casein và cho mẫu thử đã rã đông và mẫu kiểm chứng vào từng cặp giếng (100 μl cho mỗi giếng). Khi thêm thuốc thử phải thực hiện từ bên trái đĩa sang bên phải của đĩa. các đĩa chứa các chất cấy độc tố và mẫu kiểm chứng trong 2 h ± 5 min ở 35 °C ± 2 °C.

lặp lại các độc tố kiểm chứng đặc hiệu typ A, B, E và F đã biết trên các đĩa tương ứng. 100 μl dung dịch đệm casein trong các cặp giếng thay cho các chất cấy th nghiệm hoặc kiểm chứng để kiểm chứng mẫu trắng. Chuẩn bị các thuốc thử kháng th dán nhãn biotin typ A, B, E và F (4.5) như hưng dẫn kèm theo khoảng 15 min đến 30 min trước khi sử dụng và trong khi ủ các mẫu thử nghiệm. Pha loãng các kháng độc tố đã biotin hóa trong dung dịch đệm casein theo hướng dẫn đi kèm. Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch TBS-T như trên. Cho các kháng độc tố đã pha loãng typ A, B, E hoặc F đã biotin hóa (100 μl cho mỗi giếng) vào các đĩa thích hợp tương ứng đã dán nhãn và ủ ấm khoảng 60 min ± 5 min 35 °C ± 2 °C.

Rửa các đĩa 5 lần bng dung dịch TBS-T như trên. B sung 100 μl dung dịch chất cộng hợp phosphatase kiềm-ExtraVidin (4.7), (pha loãng 1 μl/10 ml dung dịch đệm casein) vào từng giếng và ủ trong 60 min ± 5 min ở 35 °C ± 2 °C. Rửa đĩa 5 lần bằng TBS-T với lần cuối ngâm trong dung dịch đệm rửa (4.6) khoảng 10 min ± 2 min. Loại b hết dung dịch đệm rửa bằng cách úp đĩa và vỗ nhẹ trên khăn giấy. Hoàn nguyên cơ chất GIBCO và các dung dịch khuếch đại bằng cách cho dung dịch chất pha loãng thích hợp vào chai đựng cơ chất đông khô và chất khuếch đại (4.8). Sử dng theo hướng dẫn của nhà sản xuất sản phẩm này. Thêm 50 μl dung dịch cơ chất GIBCO và ủ khoảng 11 min đến 13 min ở 25 °C ± 2 °C trên máy lắc đĩa (5.7) (khoảng 100 r/min), sau đó thêm 50 μl dung dịch khuếch đại GIBCO và ủ 2 min đến 10 min mà không lắc.

6.3. Đọc đĩa

Cho dung dịch chất khuếch đại vào đĩa gần với máy đọc đĩa (4.8). Đọc độ hấp thụ ở 490 nm và 630 nm (bộ lọc chuẩn) khi các phép kiểm chứng dương tính đạt độ hấp thụ từ 0,8 đến 1,2 và các phép kiểm chứng âm tính được chấp nhận. Lấy độ hấp thụ ở bước sóng 490 nm trừ đi độ hấp thụ ở bước sóng 630 nm. Dừng phân tích (cho hiện màu) bằng cách thêm 50 μl dung dịch axit sulfuric 0,3 M (4.9), có th đọc độ hấp thụ sau đó (trong khoảng 2 h). Thuốc th dừng phản ng được cho vào ở thời gian bt kỳ (từ 2 min đến 12 min) sau khi thêm chất khuếch đại vào lúc các phép kiểm chng dương tính cho độ hấp thụ khoảng 1,0 và các phép kiểm chứng âm tính là chấp nhn được (không quá 0,2 trên mức nền).

6.4. Giải thích kết quả

Phép thử dương tính là khi có giá tr độ hấp thụ > 0,2 trên giá tr độ hấp thụ quan sát được trong các giếng kiểm chứng âm tính. Có thể có phản ứng chéo giữa các mẫu độc tố. Nếu các đĩa không được rửa sạch hoàn toàn, thì có thể quan sát thấy hấp thụ nền cao hơn trong tất cả các giếng.

6.5. Khẳng định kết quả

Các kết quả ELISA dương tính giả định về độc tố C. botulinum và phi được khẳng định bằng phương pháp chun quy định trong TCVN 9049:2012.

7. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp th đã sử dụng, viện dẫn tiêu chun này;

c) các kết quả thu được;

d) ngày kết thúc thử nghiệm;

e) tất cả các chi tiết thao tác không quy đnh trong tiêu chun này cùng vi mọi tình huống bất thường khác có th ảnh hưng đến kết quả.

 

PHỤ LỤC A

(Tham Khảo)

KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM LIÊN PHÒNG

Bảng A.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng v việc phát hiện các độc t botulinum (≥ 1 MLD/ml) trong TPGYa bng các phương pháp ELISA khuếch đại và phương pháp chuẩn

Typ độc tố

A

B

E

F

Mức độc tốb)

Cao

Cao khôngA

Thấp

Thp khôngA

Cao

Cao không có B

Thấp

Thp không có B

Cao

Cao không có E

Thấp

Thp không có E

Cao

Cao không có F

Thấp

Thp không có F

Số phòng thử nghiệm

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

9

9

Số phép thử

60

340

60

340

120

280

120

280

60

340

60

340

110

290

98

261

Các phép thử giả định dương tính

+ ELISA

60

16

60

6

119

20

103

9

59

22

59

11

101

83

91

26

+ AOACc)

60

0

60

0

120

0

120

0

60

0

60

0

110

0

98

0

Khi bình phươngd)

14,1

 

4,17

 

15,4

 

3,12

 

17,4

 

6,75

 

57,9

 

3,69

 

Độ nhạy, %

+ ELISA

100

 

100

 

99,2

 

85,8

 

98,3

 

98,3

 

91,8

 

87,5

 

+ AOAC

100

 

100

 

100

 

100

 

100

 

100

 

100

 

100

 

Tỷ lệ âm tính giả trong tổng s các mẫu dương tính, %

+ ELISA

0

 

0

 

0,8

 

14,2

 

1,7

 

1,7

 

8,2

 

12,5

 

+ AOAC

0

 

0

 

0

 

0

 

0

 

0

 

0

 

0

 

Độ đặc hiu, %

+ ELISA

 

95,3

 

98,5

 

92,9

 

96,8

 

94,5

 

97,3

 

71,4

 

90

+ AOAC

 

100

 

100

 

100

 

100

 

100

 

100

 

100

 

100

Tỷ lơng tính giả trong tổng số các mẫu âm tính, %

+ ELISA

 

4,7

 

1,5

 

7,1

 

3,2

 

5,5

 

2,7

 

28,6

 

10

+ AOAC

 

0

 

0

 

0

 

0

 

0

 

0

 

0

 

0

Sự thống nhất giữa phương pháp ELISA và AOAC, %e)

96

 

99

 

95

 

94

 

94

 

97

 

77

 

91

 

CHÚ THÍCH:

a) TPGY là canh thang cht chiết nm men glucose pepton trypton

b) Kết quả cao là các mẫu chứa độc tố mức cao; Kết quả thp là các mẫu chứa độc tố ở mức thấp; Không có B là các mẫu cht cy không sinh độc tố typ A; Không có A là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ B; Không có E là các mẫu chất cấy không sinh độc t typ E; Không có F là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ F.

c) Kết quả dương tính giả đnh. Phương pháp AOAC đã được thực hiện ch trong phòng th nghiệm nghiên cu.

d) Khi bình phương được xác định bi McNemar là (la - bl - 1)2/(a-b), trong đó: a là các phần mu th (A cao hoặc cao không có A) dương tính bằng ELISA và âm tính bằng AOAC, b là các phần mẫu thử âm tính bng ELISA và dương tính bằng AOAC. Giá trị khi bình phương > 3,84 cho thấy có nghĩa tại ρ < 0,05.

e) T lệ thống nht phản ánh s lượng phép xác định tương đương giữa các phương pháp ELISA và AOAC.

Bảng A.2- Kết quả thử nghiệm liên phòng về việc phát hiện các độc tố botulinum (≥ 1 MLD/ml) trong CMMa) bằng các phương pháp ELISA khuếch đại và phương pháp chuẩn

Typ độc tố

A

B

E

F

Mức độc tốb)

Cao

Cao khôngA

Thấp

Thp khôngA

Cao

Cao không có B

Thấp

Thp không có B

Cao

Cao không có E

Thấp

Thp không có E

Cao

Cao không có F

Thấp

Thp không có F

Số phòng thử nghiệm

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

9

9

Số phép thử

60

340

60

340

120

280

120

280

60

340

60

340

110

290

98

261

Các phép thử giả định dương tính

+ ELISA

55

8

58

0

119

22

110

17

45

1

46

11

60

33

52

24

+ AOACc)

50

0

50

0

120

0

120

0

30

0

30

0

50

0

44

0

Khi bình phươngd)

11,1

 

6,13

 

17,4

 

1,3

 

14,1

 

2,89

 

41

 

13,3

 

Độ nhạy, %

+ ELISA

100

 

100

 

99,2

 

91,7

 

75

 

76,7

 

54,5

 

53,1

 

+ AOAC

83,3

 

83,3

 

100

 

100

 

50

 

50

 

45,5

 

44,9

 

Tỷ l âm tính giả trong tổng s các mẫu dương tính, %

+ ELI SA

0

 

0

 

0,8

 

8,3

 

0

 

37

 

45,5

 

46,9

 

+ AOAC

16,7

 

16,7

 

0

 

0

 

50

 

50

 

54,5

 

55,1

 

Độ đặc hiệu, %

+ ELISA

 

97,6

 

100

 

92,1

 

93,9

 

99,7

 

96,7

 

88,6

 

90,8

+ AOAC

 

100

 

100

 

100

 

100

 

100

 

100

 

100

 

100

Tỷ lơng tính giả trong tổng số các mẫu âm tính, %

+ ELI SA

 

2,4

 

0

 

7,9

 

6,1

 

0,3

 

3,3

 

11,4

 

9,2

+ AOAC

 

0

 

0

 

0

 

0

 

0

 

0

 

0

 

0

Sự thống nhất giữa phương pháp ELISA và AOAC, %e)

97

 

99

 

94

 

93

 

96

 

97

 

79

 

81

 

CHÚ THÍCH:

a) CMM là canh thang thịt

b) Kết quả cao là các mẫu chứa độc tố mức cao; Kết quả thp là các mẫu chứa độc tố ở mức thấp; Không có B là các mẫu cht cy không sinh độc tố typ A; Không có A là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ B; Không có E là các mẫu chất cấy không sinh độc t typ E; Không có F là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ F.

c) Kết quả dương tính giả đnh. Phương pháp AOAC đã được thực hiện ch trong phòng th nghiệm nghiên cu.

d) Khi bình phương được xác định bi McNemar là (la - bl - 1)2/(a-b), trong đó: a là các phần mu th (A cao hoặc cao không có A) dương tính bằng ELISA và âm tính bằng AOAC, b là các phần mẫu thử âm tính bng ELISA và dương tính bằng AOAC. Giá trị khi bình phương > 3,84 cho thấy có nghĩa tại ρ < 0,05.

e) T lệ thống nht phản ánh s lượng phép xác định tương đương giữa các phương pháp ELISA và AOAC.

 

Tìm kiếm

Thông tin Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN11135:2015
Loại văn bảnTiêu chuẩn Việt Nam
Số hiệuTCVN11135:2015
Cơ quan ban hành
Người ký***
Lĩnh vựcCông nghệ- Thực phẩm
Ngày ban hành...
Ngày hiệu lực...
Tình trạng hiệu lựcKhông xác định
Cập nhật3 năm trước