Tải về định dạng Word (79.5KB) Tải về định dạng PDF (1.5MB)

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-9:2014 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8685-9:2014

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 9: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1

Vaccine testing procedure - Part 9: Avian infuenza A/H5N1 vaccine

Lời nói đầu

TCVN 8685-9:2014 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chun Đo lường Chất lượng thm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 9: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1

Vaccine testing procedure - Part 9: Avian infuenza A/H5N1 vaccine

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định yêu cầu kỹ thuật để kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 cho gà, vịt, ngan.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rt cn thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bn mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684:2011, Vắc xin và chế phm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thun khiết.

3. Lấy mẫu sản phẩm và chuẩn bị động vật thí nghiệm

3.1. Lấy mẫu sản phẩm:

Lấy mẫu sản phm theo qui định trong bảng như sau:

S lượng mẫu vắc xin và chế phẩm sinh học cần ly

Quy cách đóng gói (ml)

Số lượng mẫu ly (sản phm)

Cho tới 100

Từ 7 đến 10

Trên 100

Từ 5 đến 7

3.2. Chun b động vật thí nghim

Tùy theo yêu cầu của vắc xin, chuẩn b động vật sau:

- 10 con gà từ 2 đến 3 tun tuổi, khỏe mạnh, âm tính với kháng th kháng vi rút cúm gia cầm.

- 30 con gà từ 4 đến 5 tuần tuổi, mẫn cảm, khỏe mạnh, âm tính với kháng thể kháng vi rút cúm gia cầm.

- 45 con vịt hoặc ngan t 2 đến 3 tuần tuổi, mẫn cảm, khỏe mạnh, âm tính với kháng th kháng vi rút cúm gia cm.

4. Cách tiến hành

4.1. Kiểm tra cảm quan

Kiểm tra bằng mắt thường: Vắc xin đồng nht, không đông vón, không lắng cặn.

4.2. Kiểm tra độ thuần khiết

Kiểm tra các chỉ tiêu tạp nhiễm vi khun, tạp nhiễm nm mốc, tạp nhim Salmonella và tạp nhiễm Mycoplasma theo TCVN 8684:2011.

4.3. Kiểm tra tính an toàn

- Trên gà: tiêm cho 10 con gà từ 2 đến 3 tuần tuổi, mỗi con 2 liu vắc xin ghi trên nhãn.

- Trên vịt hoặc ngan: tiêm cho 10 con vịt hoặc ngan từ 2 đến 3 tuần tuổi, mỗi con 2 liều vắc xin ghi trên nhãn.

Theo dõi động vật thí nghiệm trong 14 ngày.

Vắc xin được coi là an toàn nếu tt cả gà/vịt/ngan sống khỏe mạnh, phát trin bình thường và không có biến đổi bt thường v cục bộ hay triệu chứng toàn thân.

4.4. Kiểm tra hiu lực

4.4.1. Phương pháp trọng tài

Sử dụng 15 con gà khỏe từ 4 đến 5 tuần tuổi, chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 10 con gà, mỗi con được tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn, theo đường dưới da cổ;

+ Nhóm 2: gồm 5 con gà làm đối chứng, không tiêm vc xin.

Sử dụng 15 vịt hoặc ngan khỏe từ 2 đến 3 tuần tuổi, chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 10 con vịt hoặc ngan, tiêm dưới da 2 liều vắc xin (0,5 ml/con vào ngày tuổi thứ 14 và 1 ml vào ngày tui thứ 35);

+ Nhóm 2: gồm 5 con vịt hoặc ngan làm đối chứng, không tiêm vc xin.

Sau khi tiêm 21 ngày đối với gà, 14 ngày sau mũi tiêm cuối cùng đối với vịt hoặc ngan, động vật lô được tiêm và lô đối chứng được th thách với chng vi rút cúm gia cầm cường độc H5N1 hiện hành bằng phương pháp nhỏ mũi, liều 106 TCID50/con (theo Phụ lục A).

Theo dõi động vật thí nghiệm trong 10 ngày.

Vắc xin được coi là đạt nếu:

+ Ít nht 80 % động vật lô được tiêm sống, không có bt kỳ biểu hiện nào ca bệnh cúm gia cầm;

+ Ít nhất 80 % động vật ở lô đi chng chết.

4.4.2. Phương pháp thay thế

Sau khi tiêm 21 ngày đối với gà, 14 ngày sau mũi thứ 2 đối với vịt/ngan, tt cả động vật được ly máu, thu huyết thanh làm phản ứng HI (theo Phụ lục B và Phụ lục C). Vắc xin đạt tiêu chun khi hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) của lô miễn dịch phải 4log2, trong khi đó lô đối chứng âm tính.

 

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Phương pháp chuẩn độ vi rút

A.1. Chuẩn b

- Chun b đĩa 96 giếng có 1 lớp tế bào.

- Pha loãng vi rút trong môi trường tế bào có tolylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK) trypsin.

- Pha loãng vi rút theo tỷ l 1:10, pha loãng 7 nồng độ.

A.2. Cách tiến hành

- Đánh dấu thứ tự các nng độ gây nhiễm trên đĩa tế bào.

- Mỗi đĩa cố 4 giếng dùng làm đối chứng.

- Loại bỏ môi trưng nuôi cy trong đĩa tế bào, rửa tế bào 1 ln bằng dung dch muối đệm phosphat (PBS) trước khi gây nhim 0,1 ml dung dịch pha loãng vi rút.

- Bắt đầu từ nng độ pha loãng cao nht, mỗi nồng độ gây nhiễm cho 4 giếng.

- Tiếp tục gây nhiễm các giếng tiếp theo, ngược trở lại đến nng độ pha loãng thấp nht.

- Thay đổi đầu pipet khi cần thiết.

- Đặt đĩa vào trong tủ m 37 °C trong môi trưng có 5 % CO2 trong 1 h.

- Rửa bỏ những vi rút không bám trên b mặt tế bào bằng dung dịch PBS.

- Thêm 0,5 ml môi trường có chứa dung dịch albumin huyết thanh bò (BSA), TPCK trypsin và kháng sinh.

- Đặt đĩa vào tủ m 37 °C trong môi trường có 5 % CO2 và giám sát CPE (cytopathic effect) trong thời gian từ 1 ngày đến 4 ngày.

- Ghi lại số lượng giếng dương tính và âm tính.

- Tính TCID50 (liu xâm nhiễm của virus gây hủy hoại 50 % số giếng tế bào) theo công thức spearman - Kaber.

λ.TCID50 (0,1 ml) = X + 1/2 - (Nx/n)

trong đó:

X là logarit cơ số 10 của độ pha loãng vi rút có 100 % giếng xut hiện bệnh tích tế bào;

Nx là tổng số giếng có bệnh tích tế bào trong thí nghiệm;

n là số giếng ca mỗi độ pha loãng;

λ là độ pha loãng vi rút.

 

PHỤ LỤC B

(Quy định)

Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà

B.1. Thuc thử và vt liệu thử

- Dung dịch natri citrat 4 %.

- Nước muối sinh lý (dung dch NaCI 0,85 %).

- Máu gà trống khoẻ mạnh đã trưởng thành, không có kháng th cúm và Newcastle.

- Đĩa 96 giếng ch U.

B.2. Thiết b, dụng cụ

- Máy ly tâm, có th quay với tốc độ từ 1000 r/min đến 1500 r/min.

- ng ly tâm.

- Xyranh, dung tích 5 ml.

- Máy lc (tùy chọn).

B.3. Chuẩn b hng cầu gà 1 %

- Dùng xyranh dung tích 5 ml hoặc 10 ml đ hút 1 ml (10 % th tích) dung dch chng đông (natri citrat 4 %) cho vào ống ly tâm, thêm 9 ml máu gà trống.

- Ly tâm với tốc độ từ 1000 r/min đến 1500 r/min trong 15 min, đ bỏ huyết tương, cho thêm nước muối sinh lý vào hồng cu, lắc đu. Ly tâm như trên từ 3 ln đến 4 lần đ rửa hồng cầu, hút bỏ nước trên sau lần ly tâm cuối.

- Chun bị huyễn dịch 1 % bng cách pha 1 ml hồng cầu với 99 ml nước muối sinh lý.

- Bảo quản huyn dịch hng cầu nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C. Hồng cu sau khi pha có thể dùng trong 4 ngày đến 5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết thì loại bỏ, không nên dùng).

B.4. Cách tiến hành

- Nh 50 ml nước mui sinh lý vô trùng vào đĩa 96 giếng chữ U từ giếng thứ 1 đến giếng 12 của mỗi hàng.

- Nhỏ 50 ml kháng nguyên vi rút vào cột đầu tiên ca đĩa.

- Tiếp tục pha loãng kháng nguyên kiểm tra theo cơ số 2 bằng cách chuyn 50 ml từ giếng 1 đến giếng thứ 2 và tuần tự đến giếng 11 rồi bỏ đi 50 ml.

- Giếng 12 dùng đối chứng chứa: 50 ml nước muối sinh lý và 50 ml hồng cầu gà 1%.

- Nhỏ 50 ml hng cầu gà 1% vào các giếng của đĩa phản ứng.

- Lắc nhẹ bằng tay hoặc bng máy. đĩa phn ứng nhiệt độ phòng trong thời gian khoảng 30 min,sau đó đọc kết quả.

B.5. Din giải kết quả

- Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng đu ở dưới đáy giếng thành chm tròn.

- Phản ứng dương tính: Xảy ra hiện tượng ngưng kết, hng cầu ngưng kết thành cụm lm tm xung quanh giếng.

- Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên được đánh giá ở độ pha loãng cao nht còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.

 

PHỤ LỤC C

(Quy định)

Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà

C.1. Thuốc th và vật liệu thử

- Hồng cầu gà, nồng độ từ 0,8 % đến 1 %.

- Kháng nguyên (nước trứng).

- Nước muối sinh lý (dung dịch NaCl 0,85 %).

- Đĩa ngưng kết 96 giếng đáy chữ V.

C.2. Cách tiến hành

- Đánh du mẫu huyết thanh cn kim tra lên đĩa 96 giếng đáy chữ V.

- Nhỏ 25 ml nước muối sinh lý vô trùng vào các giếng của đĩa 96 giếng.

- Nhỏ 25 ml huyết thanh cn kiểm tra vào dãy 1, pha loãng bậc 2.

- Dùng micropipet trộn đu giếng 1, chuyn 25 ml giếng 1 sang giếng 2. Tương tự đến nồng độ thích hợp. Dãy đối chứng dương nước muối sinh lý + hồng cầu, đối chứng âm kháng nguyên + hng cầu.

- Cho vào tt cả các giếng mỗi giếng 25 ml dung dịch kháng nguyên 4HA, lắc nhẹ trong vòng 1 min. Để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 min.

- Hút 50 ml dung dịch hng cầu cho vào các giếng, lắc nh trong vòng 1 min. Đ ở nhiệt độ phòng trong 30 min (khi nào đối chứng lắng hoàn toàn) và đọc kết quả.

C.3. Din gii kết qu

- Phản ng âm tính: Có hạt ngưng kết bông lởn vởn.

- Phản ứng dương tính: Hng cầu lng xuống đáy tạo chấm tròn.

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ASEAN Standard Requirements for Avian lnfluenza Vaccine

[2] Chapter 2.3.4: Avian lnfluenza, OIE Terrestrial Manual 2009

Tìm kiếm

Thông tin Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8685-9:2014
Loại văn bảnTiêu chuẩn Việt Nam
Số hiệuTCVN8685-9:2014
Cơ quan ban hành
Người ký***
Lĩnh vựcNông nghiệp
Ngày ban hành...
Ngày hiệu lực...
Tình trạng hiệu lựcKhông xác định
Cập nhật3 năm trước